Mit dem sogenannten „Thesenanschlag“ Martin Luthers am 31. Oktober 1517 begann das Zeitalter der Reformation. Die Verbreitung der Lehren Luthers, der Universitäten als päpstliche Einrichtungen strikt ablehnte, führten im Heiligen Römischen Reich in den 1520er Jahren zu einem dramatischen Rückgang der Studentenzahlen – auch an der Universität Wien. Zudem traten neu gegründete protestantische Schulen und Universitäten in Konkurrenz zu den bestehenden katholischen Institutionen.
Das Bildungswesen wurde Gegenstand und Instrument der konfessionellen Auseinandersetzungen. Unter Erzherzog Ferdinand I. begannen an der Universität Wien tiefgreifende Reformen, die darauf abzielten, reformatorisches Gedankengut zu verbannen: Sowohl Studenten (u.a. über Stipendien) als auch Professoren wurden auf ihre „Rechtgläubigkeit“ geprüft. Die Rekatholisierung der Wiener Hochschule führte nicht zuletzt 1551 zur Berufung des Jesuitenordens nach Wien.
